服务热线400-065-1811
当前位置:www.djpt8.com > 科学研究 > 资讯动态
毕氏酵母发酵过程中需氧代谢的转录组学调控机制 时间:2016-10-17
   作为一种高效外源基因表达系统的毕氏酵母,被用来表达多种外源蛋白,使用已超过30年,但优化方式却很少发生改变,对酵母发酵过程中转录组学的研究也很少。因此,通过对发酵过程中酵母细胞转录组层面的分析从而找到核心基因对发酵功能的影响是很重要的,这为发酵过程的工艺优化提供了重要的理论支撑。

研究背景

为了研究毕氏酵母发酵过程中基因的变化,吉林大学梁重阳团队以毕氏酵母对甲醇适应性发酵rHSA(人重组白蛋白)过程为模型,研究了毕氏酵母发酵过程中转录组学与关键发酵阶段的关系。该研究最近以“Transcriptional Regulation of AerobicMetabolism in Pichia pastoris Fermentation”为题发表于著名学术期刊PLOS ONE,烈冰生信团队在测序和生信分析方面给予了有力的支撑。
酵母发酵过程主要有5个时间节点,1-(12h)-对数生长期,2-(30h)-甲醇取代甘油作为能源起始点,3-(48h)-酵母适应甲醇生长阶段,4-(90h)-产物积累顶峰,5-(108h)-发酵结束和产物降解。酵母发酵过程有两个关键阶段,限制碳源替代和甲醇诱导蛋白表达。限制碳源替代就是把酵母发酵的能源从甘油转变为甲醇,酵母需要经过一段时间的适应过程才能继续生长;甲醇诱导蛋白表达是酵母适应了甲醇以后大批量生产蛋白及末期细胞凋亡和产物降解的过程。为了探究这两个阶段中基因发生的变化,分别取这两个阶段中三个重要的节点做了趋势分析(1-2-3即限制碳源替代和3-4-5即甲醇诱导蛋白表达)。用GO-Term进行聚类,最后通过co-exp-net锁定一个与氧化还原代谢相关的基因PAS_chr2-1_0582,并通过同源重组的方法敲除目的基因,发现醇类消耗是对照组的1/5,过氧化物酶体生成也是减少的。

分析思路

实验取了5个不同发酵节点的毕氏酵母,提取RNA,进行测序,分别对1-2-3和3-4-5两个阶段进行转录组学研究,通过生物信息分析,锁定目的基因,并通过基因敲除实验验证此基因在发酵过程中的核心地位。

1. 首先建立了甲醇诱导毕氏酵母发酵表达rHSA的经典发酵模型。


2. 分别对1-2-3和3-4-5两种结果进行了趋势分析,并对差异基因进行GO功能富集。发现1-2-3阶段趋势6和趋势7(上升的趋势)主要与囊孢子形成和跨膜转运等相关,而趋势0和趋势1(下降的趋势)主要与转录调节有关。这与酵母发酵生长曲线使一致的。而3-4-5阶段趋势5(先升后降)和趋势3(先平后降)主要与蛋白转运相关。



3. 分别对1-2-3和3-4-5两个阶段的相关基因做了共表达网络分析,找出核心基因。
1)对1-2-3阶段 GO分析中192个相关的基因做动态共表达网络分析,找出K-core值大于或等于10的29个核心基因,发现这些基因都集中分布在单一的子网络,均为下降的趋势,而这些基因均与细胞生长有关,这与发酵过程中细胞生长曲线是一致的。


  2)对3-4-5 阶段GO分析中231个相关的基因做动态共表达网络分析,找出此阶段核心基因,大多数核心差异基因与蛋白转运和膜转运相关。

4. 针对以上两个阶段的核心基因分别做了Go-Gene-Tree,发现两个阶段都是与氧化还原过程相关的。
1)在1-2-3阶段Go-Gene-Tree。可以看到差异基因主要与需氧呼吸和三羧酸循环有关。

  2)在3-4-5阶段Go-Gene-Tree,发现核心基因都是与氧化还原过程的步骤是相关的,比如有氧呼吸、电子传递链、NADPH生成等过程。基因主要与需氧呼吸和三羧酸循环有关。

5. 选取了与氧化还原过程相关的核心基因PAS_chr2-1_0582运用同源重组进行敲除验证发现此基因敲除可抑制醇类的消耗,证明了此基因确实与氧化还原过程相关。

文章链接:/news_more.asp?id=429

XML 地图 | Sitemap 地图