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Tophat参数测试总结报告

时间:2018-10-19    |    阅读量:1115

引言

1.1编写目的

进行该测试以及撰写此报告有以下几个目的

1.通过对测试结果的分析,得到对App质量的评价;

2.分析在Illumina测序平台下,tophat能够获得最大junction数目以及mapping率的参数;

3.分析在ionproton测序平台下,tophat能够获得最大junction数目以及mapping率的参数;

4.尝试找到参数与测序长度的经验性关系。

1.2背景

Tophat是一个RNA-seq数据分析工具,其核心程序是bowtie或bowtie2.可以快速的确认exon-exon剪切拼接。其上游App是Bowtie,下游App是Cufflinks。

理论上,Tophat是针对Illumina Genome Analyzer开发的,针对75bp以上长度的短序列进行了优化。该App是现在二代测序回帖App中使用最广泛的App。

Illumina属于二代测序中最经典的平台之一。其测序长度为几十bp。

Ionproton属于二代测序中较新的平台,可以认为是二点五代测序平台,其测序长度平均在100个bp以上。目前大家企业使用的就是这个平台的进行二代测序分析。

在目前企业的数据分析中,出现主要的问题是使用tophat进行ionproton平台分析时,默认参数的mapping率较低,同时该参数产生的junction数也很低,不足以进行差异可变剪接分析。因此,提出此次工作内容,探索更好的参数配置,提高mapping率以及junction数目。

1.3用户群

主要读者:企业研发部,企业管理人员。

其他读者:项目及销售相关人员。

1.4 数据对象:

Illumina数据

Ionproton数据

Illumina-lowliguanhu human

Ionproton-low: congsongfeng human

Illumina-highzhuanliping mouse

Ionproton-high:dingning human

1.5 测试阶段

App测试

1.6测试工具

Samtools version0.1.18

IGV version2.3.18

Awk

1.7 参考资料

Tophat user guide

测试概要

关于Tophat参数测试从2013910日开始到2013917日结束,共持续7天,一共94个测试用例,平均每个参数测试15次。

2.1工作计划进展

针对Illumina平台:

测试参数

计划开始时间

实际开始时间

计划完成时间

实际完成时间

工作完成情况

Anchor-length

2013910

2013910

2013910

2013910

顺利

Max-insertion

2013910

2013910

2013910

2013910

顺利

Max-deletion

2013910

2013910

2013910

2013910

顺利

Splice-mismatch

2013910

2013910

2013910

2013910

顺利

Read-mismatch

2013911

2013911

2013912

2013912

顺利

Read-gap-length

2013911

2013911

2013912

2013912

顺利

Read-edit-dist

2013911

2013911

2013912

2013912

顺利

Segment-length

2013912

2013912

2013912

2013912

顺利

针对ionproton平台:

测试参数

计划开始时间

实际开始时间

计划完成时间

实际完成时间

工作完成情况

Anchor-length

2013916

2013916

2013916

2013916

顺利

Max-insertion

2013916

2013916

2013916

2013916

顺利

Max-deletion

2013916

2013916

2013916

2013916

顺利

Splice-mismatch

2013916

2013916

2013916

2013916

顺利

Read-mismatch

2013916

2013916

2013916

2013916

顺利

Read-gap-length

2013916

2013916

2013916

2013916

顺利

Read-edit-dist

2013916

2013916

2013916

2013916

顺利

Segment-length

2013916

2013916

2013916

2013916

顺利

2.2测试实行

此次测试严格按照项目计划和测试计划实行,按时完成了测试计划规定的测试对象的测试。针对测试计划制定规定的测试策略,依据测试计划和测试用例,将网络数据以及大家观测的关键参数进行了完整的测试。

2.3测试用例

2.3.1功能性

测试主要实现,包括较高的mapping率以及较多的junction数目。

测试环境

3.1软硬件环境

硬件环境

服务器

硬件配置

CPUIntel Xeon 2.66GHz

Memory90GB

HD29TB

App配置

OSFedora release 14

Tophat 2.0.8

网络环境

100M LAN

测试结果

4.1针对Illumina测序平台数据

为简化回帖工作量,从测试的数据中提取了20万条reads数据进行单端测试。

通过测试,统计出anchor-length长度对于junction数目关系如下图所示:

通过测试数据可以知道对于Illumina测序平台数据而言,当anchor-length大于10以后,junction数目显著降低,而在510这个范围内没有显著变化。

通过测试数据可以知道对于Illumina测序平台数据而言,当anchor-length大于10以后,mapping率降低,但是可以通过竖轴可以观测出这个mapping率的变化并不明显。

通过测试数据可以知道对于Illumina测序平台数据而言,junction数目与mapping率基本成正比关系。

通过测试数据可以知道对于Illumina测序平台数据而言,read-mismatch数字升高与junction数目基本成反比关系,随着read-mismatch数目变长,junction数目急速降低。

通过测试数据可以知道对于Illumina测序平台数据而言,read-mismatch数字升高与mapping率基本成正比关系,随着read-mismatch数目变长,mapping率上升明显。

通过测试数据可以知道对于Illumina测序平台数据而言,read-gap数字升高与mapping率基本成正比关系,随着read-mismatch数目变长,mapping率上升。整体上升大约1.2%

通过测试数据可以知道对于Illumina测序平台数据而言,segment长度升高与junction的数目关系,在二十以内时,segment长度变长,junction数目上升明显。随着read-mismatch数目变长,mapping率上升。整体上升大约1.2%

3.2针对ionproton测序平台数据

为简化回帖工作量,从测试的数据中提取了20万条reads数据进行单端测试。

由于有了对于Illumina平台的工作支撑,所以针对ionproton的测试工作速度提高很多。

由于大家统一了read-mismatch参数,read-gap参数,以及read-edit参数。所以这三个参数的测试图都可以从上图中看出信息。

通过测试数据可以知道对于ionproton测序平台数据而言,针对同一anchor-length长度而言,长度8和长度1516的情况下junction数目可以一致,所以认为anchor-lengthjunction数目影响不明显。

通过测试数据可以知道对于ionproton测序平台数据而言,针对同一max-deletion长度而言,长度3和长度5的情况下junction数目可以一致,所以认为max-deletionjunction数目影响不明显。

由于大家统一了max-insertion参数,max-deletion参数。所以这两个个参数的测试图都可以从上图中看出信息。

通过测试数据可以知道对于ionproton测序平台数据而言,在segment-length小于36时,可以发现随着segment-length长度变长,junction数目升高。而在36以后这个数字下降,但是总体比30以内长度的大。

通过测试数据可以知道对于ionproton测序平台数据而言,在segment-length小于36时,可以发现随着segment-length长度变长,mapping总体目升高。而在36以后这个数字有下降的情况,但是总体比30以内长度的大。

五.测试结论

通过查阅已经有的资料,大家知道Illumina测序平台和ionproton平台最直观的差别在于后者的平均测序长度比前者长;在大家测试的例子中,Illumina的测序长度在50-97bp之间,而ionproton的测序长度在50235bp之间。从此可以看出两者的最合适参数应该是有差别的。通过大家的参数实验,可以知道,对于Illumina测序平台有如下实验结果:

1.贴合长度越短,匹配的reads数越高,相应的mapping率也在一定范围内会升高。可知,只需要在anchor-length5-10以内进行讨论。随着a参数的增加(从510),junction下降的数据很低,几乎维持不变。因此可以认为在5-9的范围内可以任意取值。

2.前三个参数对于序列的discard没有影响。

3.随着第一项参数的增加,junction数目下降很明显,然而mapping率却增加的很快。推测这个原因可能是因为更多的junction序列由于容错而变成能够匹配了。所以为了mapping率而言,我认为用默认参数就可以。

4.第二项参数的变化对于junction数并没有影响,对于mapping率有一些影响,但是很小。可以再0~第三项参数之间随意选取。

5.第三项参数的变化对mapping率影响很小。但是对junction的影响很大,发现这个参数越小,junction数越高。第三个参数对于junction的影响很大,这个值越小越好,由于前两个参数应该小于或等于这个参数,当第三个参数为0时,mapping率下降非常利害,所以不将前三个参数设置为0,

6.segment-length22的时候效果最好。

对于ionproton测序平台而言,大家可以获得如下结论:

1.anchor-lengthmax-deletionmax-insertionsplice-mismatch参数的变化对于junction数目,mapping率影响不大。

2.tophat的所有的参数中,read-mismatchread-gap以及read-edit对于mapping率的影响很大,大家发现在这三个参数都设置为6的时候mapping率能够提升很多,变成默认参数情况下的两倍的mapping率。

3.大家发现segment-length参数对于junction数目变化有很大影响,其中,当segment-length36时,相比默认参数6074junction数目而言,此时的junction数目为9368.总体而言,提升效果是显著的。

六.最后测试的参数

对于20reads的实验样本而言,参数及结果如下:

测试平台

read-mismatch

read-gap-length

read-edit-dist

a

m

maxinsertion

max-deletion

segment

junction_num

unmapped

Illumina

1

1

1

8

1

3

3

22

4957

42902

ionproton

6

6

6

8

0

5

5

36

9368

96725





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