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单细胞测序困难重重,烈冰关键技术——细胞消化悬浮方案

时间:2018-07-20    |    阅读量:4863

前方高能!单细胞测序实验人员请迅速集合!迅速集合!

上回说到,走在生命科学研究前沿的急先锋们,已经了解了单细胞测序在各自研究方向上的应用与价值,正摩拳擦掌准备大干一番,却遇到了重重障碍。今天,大家就来聊一聊单细胞测序第一个“拦路虎”----单细胞消化与悬液制备,以及实验过程中潜在的那些“坑”。

目前,单细胞测序的主要应用领域为人类医学、神经生物学、遗传生殖、干细胞等研究领域,涉及到的主要样品类型十分广泛,但根据其来源,可分为如下几个大类:1)肿瘤组织,如肝癌、胃癌、乳腺癌等;2)实体组织来源的原代分离细胞,如脑神经元、肠道组织来源的上皮及干性细胞等;3)血液来源的某些细胞亚群(一般可以通过不同biomarker进行FACS分选),如通过5色标记的造血干细胞群体;4)干细胞诱导分化/重编程相关的细胞样品。

如何根据自己课题的方案设计及样品类型,选择合适的单细胞制备方法,是事关成败的第一要素!(生信分析的同学先沉着一下,没说你们不重要,毕竟好的样品通过好的测序技术得到好的RAW DATA才能发挥你们的生信优势对不!)CNS文章里的方法学,写的都很(bu) (xi) 典(zhi),看了之后还是一头雾水。质量浓度单位还是活性浓度单位?That is a question.

因此烈冰的实验团队决定自己动手做一批动物实验,摸索并优化出一套更适用的单细胞悬液制备方案。

l 实验目的:比较不同类型胶原酶消化针对不同类型组织的消化效果,摸索出适用于小鼠不同组织器官(如心、肝、脾、肺、肾和脑)的消化条件。

l 实验材料:剪刀、镊子等器械需提前灭菌处理,RPMI-1640FBSD-Hanks`缓冲液(也可以换成含有Ca2+HBBS)。胶原酶I/II/IV/V(具体类型及对应货号如下图)。

l 实验方法:以肝脏、心脏为例,进行演示,详细流程及注释事项如下图所示。

注释事项:

① 剖解小鼠,取其具体靶器官时,一般采取断颈的方式,优势是处理快速、方法通用,但会引起体内局部(尤其是胸腔)内凝血,对心脏、主动脉和肺等组织有一定影响;剖解过程,务必快速准确,尽量减少细胞活性的损失;

冲洗过程,一般采用预冷的生理盐水/PBS/D-Hanks`/RPMI-1640等液体。此步骤注意两点:预冷+维持细胞活性的“液体”。一般情况下,建议RPMI-1640添加FBS10%终体积(其实就是完全培养液)。也有老师用终浓度1-5%的BSA,其实作用都是为了提高细胞悬液制备过程中的细胞活性。

剪碎过程,注意两点:快速+越小越碎越好。可以准备一次性的平皿,提前注入5-10 ml预冷的完全培养液,在预冷环境中剪碎组织。

④ 胶原酶消化,这一步注意事项较多。首先,明确适用于该组织的胶原酶,详细情况见上面表格;一般情况下,IV型最通用,但特殊类型的组织用单一类型的酶效果更好;另外,根据研究目的,如果样品所处微环境组织类型复杂,可以配成混合型的胶原酶,如II+IV型;第二,使用终浓度,大家整理了20+的CNS文章,发现有编辑用质量浓度mg/ml,也有的用活性单位浓度UI/ml,考虑到各企业货品单位质量对应的活性不同,建议以活性单位浓度UI/ml为基准。大多数的IIIV型胶原酶的使用浓度为100-200 UI/ml。最后,注意消化时间。一般情况下,胶原酶在37℃条件下活性最强,消化时间为20-30 min;也有文章在处理肿瘤组织时,消化4 h甚至过夜。不敢多想,深表怀疑。另外,也有老师喜欢用4℃消化过夜的方式,细胞数量和活性也都还不错,可以尝试,但可能不会通用于所有类型的组织。

⑤ 终止酶的消化,一般来说都是加入血清的。但是,由于胶原酶本身不受血清影响,因此,只能采用离心—弃上清—加培养液重悬的“素质三连”来洗去残留的胶原酶。至于细胞碎片,这一步基本上都是通过低转速短时间离心的方式进行的,基本上300 g,5 min即可。既保证活细胞离心收集,又保证细胞碎片悬浮在上清中被弃掉。如果,老式离心机只能调节转速(rpm),没有g这一选项的话,一般情况下是1000-1500 rpm。

⑥ 红细胞裂解,这一步其实很纠结。先说结论,该裂还是要裂的,不过尽量在初步分离细胞的时候把红细胞去除干净。不过,像心脏和肝脏这样的组织,本身红细胞含量就超级高,裂红在所难免。至于为什么纠结,因为有些细胞类型被裂红试剂处理后,会发生聚集并收缩在一团,用移液器轻微的吹打不容易将其分开,会影响后续实验的单细胞得率。

最终,在检测细胞活性/数量的时候,再啰嗦几句。以本人十几年的实验经验(暴露年龄了),要么走经典路线,光学显微镜+细胞计数板+台盼蓝;要么走高科技路线,活/死细胞荧光染料染色后全自动计数仪操作。这里不建议用台盼蓝染色,再全自动计数的仪器,贵不贵不是最重要的,关键是不准确,且批次间可重复性太低,低到你崩溃。明明镜下观察活性相当客观,为何全自动说细胞都挂了呢,不思其解。问了周围的小伙伴,以及销售器材的一些朋友,确实也有不少人碰到过这一情况。

最后,给大家提一些单细胞悬液制备的注意事项:

1) 针对具体组织类型选对酶,以及使用浓度;多种类型组织共存,可配置混合型酶反应液;提前摸索活性浓度;

2) 酶干粉配置母液时要含有Ca2+离子才能激活活性;

3) 需要预冷的,需要室温的,或者需要37℃的,都提前准备好。一般情况下,酶消化用37℃,其他分离过程用4℃减少活性损失(包括离心);

4) 组织剪的越小,分离效果越好;

5) 离心机最好是带g的,300 g+5 min通用全程;不带g的话,1000-1500rpm即可,转速过高,细胞活性会受影响,碎片也越多。

6)说了这么多,希翼对大家的实验有帮助。如果还有其他实验技术疑问,可以关注大家的微信公众号(烈冰生物),烈冰还会陆续分享更多关于单细胞测序的实验技术和数据分析技巧。


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