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【空间转录组】第一弹之原理与样本制备,你都了解了吗?

时间:2020-04-08    |    阅读量:1377


烈冰生物已经正式推出了Visium空间转录组测序及数据分析服务,(技术抢先看|全新空间转录组测序数据分析策略来咯~)为了更好地帮助客户理解空间转录组测序,得到完美的组织切片,获得最优质的数据分析结果,本期开始,小编将为大家详细先容空间转录组测序的原理、样本制备、实验流程、案例分析、文章解读等信息。


其实,空间转录组的概念早在2016年就已经存在了,目前已经发表的空间转录组技术有 Slide-seq、LCM-seq、seqFISH、MERFISH、Liver single cell zonation以及 Tomo-seq。但是这些方法存在操作复杂、检测精度不准确、基因和细胞检测量的限制等问题,无法大规模商业推广。


基于Spatial Transcriptomics升级改进后的Visium空间转录组,是目前唯一一款高精度、高通量的商业化空间转录组测序方案,工作流程简单,从组织切片到文库构建仅需一天,大大节省时间成本。其本质是通过空间条形码捕获探针,高通量的原位检测冷冻组织切片中不同区域的RNA的表达模式以及空间分布。

当组织冷冻切片附在带有spatial barcode的空间转录组载片上时,通过探针上条形码引物结合并从组织中捕获邻近的mRNA。被捕获的mRNA开始逆转录,得到的cDNA中包含了spatial barcode序列。通过上机测序,可以将每个mRNA转录的序列映射回组织切片中的起始位置。

Visium空间转录组的核心在于载玻片部分,正式文库构建的载玻片上有4个捕获区域(6.5mm X 6.5mm,可以加4个样本),每个捕获区域含有约5000个被条形码标记的点(barcoded spots),每个spot直径55μm,spot与spot中心点之间的距离为100μm,每个 spot含有上百万个可以与mRNA结合的捕获探针,每个探针上都带有独特的spatial barcodes,用以标记捕获的mRNA的空间位置。



空间转录组实验流程

因为空间转录组测序是对组织切片进行操作,需要将组织进行切片。因此客户在制备样本时,需要将新鲜的组织冻存并进行OCT包埋 后续的冷冻切片、RNA 捕获及文库构建等操作可以视具体情况带回企业进行实验。

1、组织冻存

将组织进行冻存的目的是为了得到保护RNA的质量及组织形态的完整,从而真实的反映出细胞和基因在空间中的分布情况。因此,拿到新鲜组织后,需要对组织样本进行异戊烷速冻

2、OCT包埋

OCT是一种固形剂,在冰冻切片时可以支撑组织,增加组织的连续性,减少皱折及碎裂,以保存组织结构完整性。


3、冷冻切片

将质检合格的冷冻组织和10x玻片先放-20℃冷冻切片机箱体中平衡30分钟以上,再进行切片。


4、文库构建


将组织切片贴合在带有mRNA结合捕获探针的载玻片上,通过甲醛固定、H&E染色拍照得到组织切片的形态结构。再进行透化处理,使细胞中的mRNA释放,并结合到芯片相邻的捕获探针上。将捕获的mRNA反转录合成cDNA构建测序文库进行上机测序,从而获取基因表达信息。







总体来说,空间转录组的实验流程包括:组织冻存-OCT包埋-冷冻切片-固定染色-组织透化-cDNA合成及建库-上机测序,而需要客户进行样本准备的步骤相对简单:组织冻存与OCT包埋。


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